شمارش کلی میکروبی
مولف : خانم شیدا محمدی
شمارش باکتری‌ها
در آزمایش‌های میکروبی باید بتوانیم تعداد باکتری‌ها را بشماریم. این شمارش می‌تواند در یک‌سان‌سازی دوز مصرفی باکتری یا مقایسه و سنجش اثر یک ماده بر شمار باکتری‌ها به کار برده شود. روش‌های گوناگونی برای شمارش باکتری‌ها به کار می‌رود که به هدف شمارش، امکانات موجود و مایع یا جامد بودن کشت باکتری بستگی دارد.
روش تهیه‌ی رقت:
ابتدایی‌ترین روش شمارش باکتری‌ها کشت دادن حجم خاصی از سوسپانسیون آنها روی محیط کشت می‌باشد. در این روش حجم خاصی از سوسپانسیون باکتری روی محیط کشت جامد کشت داده می‌شود و پس از سپری‌شدن زمان لازم برای رشد باکتری، تعداد کلنی‌ها شمارش می‌شود (اگر این حجم خیلی کم باشد دقت کار پایین می‌آید). هر کلنی به توده‌ای از باکتری‌ها گفته می‌شود که در نتیجه‌ی رشد یک عدد باکتری اولیه روی محیط جامد ایجاد شده است.
بنابراین پس از رشد، می‌توان تعداد کلنی‌ها را برابر با تعداد باکتری‌ها در سوسپانسیون اولیه در نظر گرفت. ایراد این روش، فراگیر نبودن آن می‌باشد. زیرا در صورتی که تعداد باکتری‌ها خیلی زیاد باشد، آنها تمام سطح پلیت را می‌پوشانند و تفکیک و شمارش تعداد کلنی‌ها ممکن نیست. از طرفی برخی میکروب‌ها ممکن است روی محیط جامد قابل کشت نباشند. اما با این حال هنوز این روش در بسیاری موارد کاربردی و مفید است.
شمارش کلونی ها:
دو روش برای شمارش کلونی ها وجود دارد:
الف) دستگاه کلونی کانتر که به طور اتوماتیک تعداد کلونی ها را در یک رقت مشخص نشان می دهد.
ب) روش دستی که پلیت را به صورت وارونه بر روی یک صفحه سفید یا سیاه قرار داده و بین پلیت و صفحه یک شیشه شطرنجی قرار دارد و با علامت گذاری خانه ها تعداد را بدست می آوردند.
روش محاسبه:
الف) شمارش کلی میکروبی ( محاسبه استاندارد)← جهت شمارش پلیت هایی انتخاب شوند که بین ۳۰ تا ۳۰۰ کلونی داشته باشند که برابر میانگین تعداد کلونی های شمارش شده در دو پلیت ضرب در ضریب رقت بکار رفته.
ب) محاسبه تخمینی← اگر در تمام رقت ها بیش از ۳۰۰ کلونی در هر پلیت دیده شود ، سطح هر پلیت را به شعاع های مناسب تقسیم می کنیم و کلونی ها را در یک قسمت شمارش کرده و سپس تعداد کل را در ضریب مناسب ضرب می کنیم. میانگین شمارش را در دو پلیت محاسبه و در ضریب رقت ضرب و نتیجه را به عنوان تخمین شمارش کلونی گزارش می کنند.
کشت در پلیت : به سه روش قابل انجام است .
۱- کشت خطی
۲- کشت سطحی
۳- کشت آمیخته یا پورپلیت
کشت سطحی :
در این نوع کشت هم از محیط پیش ریخته استفاده می شود.
نحوه کشت :
این روش کشت بیشتر برای محیطهای مایع میکروبی کاربرد دارد و یا اگر محیط مایعی مانند شیر مشکوک به آلودگی میکروبی باشد آن را می توان به این روش کشت میکروبی داده و میکروارگانیسمهای موجود در آن را مشخص نمود.
برای اینکار ابتدا یک رقت معینی از محیط مایع تهیه نمائید. سپس با استفاده از پیپت استریل مقدار مشخصی از آن رقت را برداشته و در سطح محیط جامد پیش ریخته توسط میله پخش کننده یا توک آنس پخش نمائید. و بعد از انکوباسیون می توانید کلنی های رشد یافته در سطح محیط کشت را مشاهده کنید توجه داشته باشید که هنگام انجام کشت سطحی باید سطح محیط خشک باشد .
چون هنگام ریختن محیط کشت بصورت پیش ریخته ممکن است بخار آب روی درب پلیت و سطح محیط جمع شود برای خشک کردن آن می توان محیطها را در یک گرمخانه با دمای ۵۰-۲۵ درجه قرار داده و خشک نمود.به این ترتیب که درب پلیت را برداشته و قسمت محتوی محیط کشت را وارونه روی لبه درب قرار دهید تا قطرات رطوبت حذف گردد.
همچنین می توانید پس از ریختن محیط کشت در پلیت در صورت تجمع حباب هوا ، آنها را با شعله دادن سطح محیط حذف نمائید. اینکار باعث سترون شدن سطح محیط کشت هم می شود.
کشت آمیخته یا پورپلیت :
در این روش کشت هم نیاز به تهیه سوسپانسیون از باکتری می باشد . یعنی باید از باکتری مورد نظر در محیط مایع رقت معینی را تهیه نموده بعد به میزان ۱ سی سی از آنرا در کف پلیت استریل ریخته سپس از محیط کشت مورد نظر که قبلا استریل شده و حرارت آن به حدود ۴۵ درجه سانتیگراد رسیده بمیزان ۱۵-۲۰ سی سی به پلیت اضافه نمائی. سپس با حرکات دورانی بصورت عدد ۸ انگلیسی آنرا کاملا مخلوط کنید. اگر نیاز بود مجددا سطح محیط آمیخته با باکتری را با یک لایه نازکی از همان محیز کشت بپوشانید دراینحالت به آن کشت دولایه هم گفته می شود.
برای انجام این آزمایش به ابزار زیر نیازمندیم:
پلیت ، لوله آزمایش ، پیپت ۲و۵سی سی ، سرم فیزیولوژی ، محیط کشت نوترینت آگار، دستگاه کلونی کانتر ، انکوباتور ، سوسپانسیون باکتری E.coli
شرح آزمایش:
۸ عدد لوله‌ی آزمایش دربسته حاوی ۹ میلی‌لیتر سرم فیژیولوژی ریخته را استریل کنید. لوله‌ها را از ۱ تا ۸ شماره‌گذاری کنید و به ترتیب درون جا لوله‌ای قرار دهید.
از نمونه‌ی اولیه سوسپانسیون باکتری E.coli که می‌خواهید باکتری‌های آن را بشمارید یک میلی‌لیتر در شرایط استریل (کنار شعله یا زیر هود) به لوله‌ی شماره‌ی ۱ منتقل کنید.
محتوای لوله‌ی اول را خوب مخلوط کنید تا رقت ۱-۱۰ شما کاملاً یک نواخت گردد. سپس ۱ میلی‌لیتر از آن را در شرایط استریل به لوله‌ی بعدی منتقل کنید.
مرحله‌ی قبل را به ترتیب برای لوله‌های بعدی تکرار کنید تا رقت ۸-۱۰ به دست آید.از آخرین لوله ۱cc را بیرون ریخته تا تمام لوله آزمایش ها ۹cc باشند. در شکل زیر همین روند را مشاهده می‌کنید. هر چه رنگ کم‌رنگ‌تر می‌شود نشان‌دهنده‌ی رقیق‌تر شدن سوسپانسیون اولیه است.
حال که رقت ها را تهیه کردیم ، نوبت به کشت آنها می رسد. برای هر رقت یک پلیت استریل مشخص می کنیم. از هر لوله مقدار ۰/۱ml برداشته و به داخل پلیت های مربوط به آن رقت می ریزیم .
روش پور پلیت:
پس از این کار حدودا ۱۵ cc از محیط نوترینت آگار را در هر پلیت می ریزیم ( البته به علت کمبود محیط کشت مقداری کمتر از ۱۵ cc در هر پلیت ریختیم ). دمای محیط کشت نباید زیاد باشد تا میکروارگانیسم ها کشته شوند ؛ تقریبا حدود ۴۵ تا ۵۰ درجه سانتیگراد.
پلیت ها را ۵ مرتبه به شکل ۸ حرکت می دهیم تا محلول یکنواخت شود. سپس آنها را بی حرکت می گذاریم تا بسته شود.
پلیت ها را باید علامت گذاری کنیم که شامل رقت ، گروه ، ساعت و روز کلاس می شود.
پلیت ها را در انکوباتور ۳۲ درجه به مدت ۴۸ ساعت قرار دادیم. بعد از رشد کلونی ها نوبت به شمارش آنها می رسد. برای دقت در کار بهتر است که تمام پلیت ها را شمارش کنیم.
روش سطحی:
پلیت نوترینت آگار را برداشته از هر رقت ۰/۱ml برداشته و به محیط اضافه میکنیم و با میله سرکج آن را کاملا ماساژ می دهیم.
پلیت ها را در انکوباتور ۳۲ درجه به مدت ۴۸ ساعت قرار دادیم. بعد از رشد کلونی ها نوبت به شمارش آنها می رسد. برای دقت در کار بهتر است که تمام پلیت ها را شمارش کنیم.
پلیت ها را روی دستگاه کلونی کانتر گذاشته با ماژیک روی کلونی ها علامت گذاشته و می شماریم
نتایج:
روش کشت خطی:
۱-۲-۳= بیش از ۳۰۰ کلونی
۴=۲۹۶ کلونی
۵=۲۲۵ کلونی
۶=۸۹ کلونی
۷=۹ کلونی
۸=۶ کلونی
۲۹۶+۲۲۵+۸۹=۶۱۰
۳= ۲۰۳/۳÷ ۶۱۰ میانگین کلونی های هر رقت شمارش شده
۱۰-۴ + ۱۰-۵+ ۱۰-۶)= )÷NCFU=203/3
۱۰+۴×۱/۸۳۱
روش پورپلیت:
۱= بیش از ۳۰۰ کلونی
۳=۲۷۵ کلونی
۴=۱۰۰ کلونی
۵=۲۵ کلونی
۶=۷ کلونی
۷=۲ کلونی
۸=۱ کلونی
۲۷۵+۱۰۰=۳۷۵
۲=۱۸۷/۵÷۳۷۵ میانگین کلونی های هر رقت شمارش شده
۱۰ -۳ +۱۰-۴)= )÷NCFU=187/5
۱۰+۳×۱۷/۰۴۵
تماس با کارشناسان 