شمارش کلی فرمها
مولف : آقای مختار عباسی
۱ ـ هدف و دامنه کاربرد
هدف از تدوین این استاندارد ارائه روش برای جستجو , و شمارش کلی فرمها به روش پرگنه و بیشترین تعداد احتمالی۱ در مواد غذایی میباشد .
۲ ـ تعریف
در این استاندارد منظور از کلیفرمها باکتریهایی هستند که در دمای ۳۷ درجه سلسیوس قادرند لاکتوز را تخمیر نموده , اسید و گاز تولید نمایند .
۳ ـ محیطهای کشت و محلولهای رقیق کننده
۳ ـ ۱ ـ محیطهای کشت
۳ ـ ۱ ـ ۱ ـ محیط کشت آبگوشت لوریل سولفات ترپیتوز Lauryl sulfate tryptose broth ( محیط کشت غنی کننده انتخابی )
ترکیب :
روش تهیه :
ترکیبات فوق را در آب حل نموده و در صورت لزوم حرارت دهید . pH محیط را تنظیم کنید تا پس از سترون شدن در ۲۵ درجه سلسیوس ۶/۸ باشد .
سپس محیط کشت با غلظت معمولی و غلظت دو برابر را در حجمهای ۱۰ میلی لیتر به ترتیب در لولههایی به ابعاد ۱۶۰*۱۶ و ۲۰۰*۲۰ میلی متری دارای لوله درهام مناسب تقسیم و سپس لولهها را در اتوکلاو قرار داده و در ۱۲۱ درجه سلسیوس به مدت ۱۵ دقیقه سترون نمائید . پس از سترون شدن , لولههای درهام بایستی عاری از حباب هوا باشند .
در صورتی که محیط فوق به صورت تجارتی در دسترس میباشد طبق دستور سازنده عمل نمائید .
۳ ـ ۱ ـ ۲ ـ محیط کشت آبگوشت سبز درخشان دارای لاکتوز و صفرا ( محیط تائیدی )
روش تهیه :
ترکیبات فوق را در آب حل نموده و در صورت لزوم حرارت دهید .
PH محیط را تنظیم نمائید تا پس از سترون شدن در ۲۵ درجه سلسیوس ۷/۲ باشد . سپس محیط را در مقادیر ۱۰ میلی لیتری در لولههایی به ابعاد ۱۶۰*۱۶ میلی متری دارای لوله درهام تقسیم نموده و در اتو کلاو ۱۲۱ درجه سلسیوس به مدت ۱۵ دقیقه سترون نمائید . پس از سترون شدن , لولههای درهام بایستی عاری از حباب هوا باشند . محیط فوق به صورت تجارتی نیز در دسترس میباشد که در صورت استفاده از آن طبق دستور سازنده عمل نمائید .
۳ ـ ۱ ـ ۳ ـ محیط کشت آبگوشت لاکتوز Latose broth
روش تهیه :
مواد فوق را در آب حل نموده و pH محیط را تنظیم کنید تا پس از سترون شدن در ۲۵ درجه سلسیوس ۶/۹±۰/۱ باشد . سپس محیط کشت با غلظت معمولی و غلظت دو برابر را در حجمهای ۱۰ میلی لیتری به ترتیب در لولههایی به ابعاد ۱۶۰*۱۶ و ۲۰۰*۲۰ میلی متر دارای لوله درهام تقسیم نموده و در اتوکلاو ۱۲۱ درجه سلسیوس به مدت ۱۵ دقیقه سترون نمائید . پس از سترون شدن , لولههای درهام بایستی عاری از حباب هوا باشند .
محیط فوق به صورت تجارتی در دسترس میباشد که در این صورت بایستی طبق دستور سازنده عمل کنید .
۳ ـ ۱ ـ ۴ ـ محیط کشت کریستال ویولت نوترال رد بایل لاکتوز آگار
روش تهیه :
ترکیبات فوق را در آب مخلوط نموده و ضمن هم زدن محیط به مدت ۲ دقیقه آن را بجوشانید و در بن ماری ۴۵ درجه سلسیوس قرار دهید . pH نهایی در ۲۵ درجه سلسیوس بایستی ۷/۴ باشد .
از حرارت زیاد و یا حرارت مجدد به محیط بپرهیزید و سترون بودن محیط کشت را در هنگام آزمایش کنترل نمائید . محیط را حداکثر تا سه ساعت پس از تهیه مصرف کنید . محیط فوق به صورت تجارتی در دسترس میباشد که در صورت استفاده از آن طبق دستور سازنده عمل نمائید .
۳ ـ ۲ ـ محلولهای رقیق کننده
محلولهای رقیق کننده را طبق استاندارد شماره ۳۵۶ ملی ایران ( آماده کردن نمونههای مواد غذایی و شمارش میکروارگانیسمها ) تهیه کنید .
۴ ـ دستگاهها و وسایل لازم
از دستگاهها و وسایل معمول در آزمایشگاه میکروبیولوژی استفاده نمائید .
۵ ـ آماده سازی نمونه
نمونه مورد آزمون را طبق استاندارد شماره ۳۵۶ ملی ایران رقیق کنید . در مواردی که نمونه مورد آزمون شدیدا آلوده میباشد , نمونه اولیه را رقیق نموده و سپس بر روی رقت تهیه شده آزمایش را انجام دهید در این صورت عدد به دست آمده را بایستی در ضریب رقت ضرب نمائید .
۶ ـ روش آزمون
۶ ـ ۱ ـ در مواردی که هدف جستجوی کلی فرمها در یک میلی لیتر یا یک گرم از نمونه است شمارش مورد نظر نمیباشد به ترتیب زیر عمل نمائید :
۶ ـ ۱ ـ ۱ ـ یک میلی متر از نمونه را در صورت مایع بودن به محیط کشت بند (۳ ـ ۱ ـ ۱) با غلظت معمولی و در صورت غیر مایع بودن نمونه ۱۰ میلی لیتر از سوسپانسیون اولیه را به محیط کشت بند (۳ ـ ۱ ـ ۱) با غلظت دو برابر اضافه نموده و مدت ۲۴ الی ۴۸ ساعت در ۳۷ درجه سلسیوس گرم خانه گذاری نمائید .
۶ ـ ۱ ـ ۲ ـ پس از گذشت ۴۸ ساعت اگر در لوله گاز تشکیل نگردد , نمونه از نظر وجود کلی فرمها منفی خواهد بود .
۶ ـ ۱ ـ ۳ ـ اگر پس از ۴۸ ساعت در لوله گاز تشکیل شود برای تائید توسط حلقه کشت ( قطر حلقه سه میلی متر ) یک حلقه کامل یا با پیپت سترون یک قطره از لوله محتوی گاز برداشت نموده و در محیط کشت بند (۳ ـ ۱ ـ ۲) تلقیح نمائید و مدت ۲۴ الی ۴۸ ساعت در ۳۷ درجه سلسیوس گرم خانه گذاری نمائید .
۶ ـ ۱ ـ ۴ ـ اگر پس از ۴۸ ساعت در لوله آزمایش گاز تشکیل نگردد نمونه از نظر وجود کلی فرمها تائید نمیگردد , ولی اگر گاز در لوله تشکیل گردد نمونه از نظر وجود کلی فرمها مثبت تلقی میگردد .
۶ ـ ۲ شمارش
۶ ـ ۲ ـ ۱ ـ شمارش پرگنه
۶ ـ ۲ ـ ۱ ـ ۱ دو پلیت سترون به اندازه ۱۰۰ ـ ۹۰ میلی متری را بردارید و توسط پیپت سترون به هرکدام از آنها به طور جداگانه یک میلی لیتر از نمونه مورد آزمون در صورت مایع بودن و یا یک میلی لیتر از سوسپانسیون اولیه را در مورد فرآوردههای غیر مایع اضافه نمائید . در صورت نیاز برای رقتهای بعدی نیز همین عمل را تکرار کنید .
۶ ـ ۲ ـ ۱ ـ ۲ به هر یک از پلیتها ۱۵ میلی لیتر از محیط کشت بند (۳ ـ ۱ ـ ۴) را که دمای آن در حدود ۴۵ درجه سلسیوس میباشد را اضافه نمائید .
محیط کشت و نمونه مورد آزمون را به خوبی مخلوط نمائید و تا جامد شدن محیط آن را بر روی سطح صاف و خنک قرار دهید زمان بین تهیه اولین رقت و اضافه نمودن محیط کشت نبایستی از ۱۵ دقیقه تجاوز نماید .
برای کنترل سترونی محیط کشت یک پلیت شاهد در نظر گرفته و حدود ۱۵ میلی لیتر محیط کشت به آن بیفزائید .
۶ ـ ۲ ـ ۱ ـ ۳ ـ پس از جامد شدن محیط حدود ۴ میلی لیتر دیگر از محیط کشت بند (۳ ـ ۱ ـ ۴) را که دمای آن در حدود ۴۵ درجه سلسیوس میباشد را به پلیت اضافه کنید .
۶ ـ ۲ ـ ۱ ـ ۴ ـ پس از جامد شدن محیط پلیتها را به طور وارونه به مدت ۲۴±۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سلسیوس گرم خانه گذاری نمائید . در صورت عدم رشد ۲۴ ساعت دیگر نیز آنها را در گرمخانه قرار دهید .
۶ ـ ۲ ـ ۱ ـ ۵ ـ پس از اتمام دوره گرمخانه گذاری پلیتهای حاوی کمتر از ۱۵۰ پرگنه را برای شمارش انتخاب کنید . پرکنههای قرمز مایل به ارغوانی با قطری در حدود ۰/۵ میلیمتر یا بیشتر که گاهی با ناحیه قرمز رنگ احاطه شدهاند را برای شمارش انتخاب کنید .
۶ ـ ۲ ـ ۲ ـ شمارش بیشترین تعداد احتمالی به روش سه لولهای
۶ ـ ۲ ـ ۲ ـ ۱ نه لوله آزمایش که ۳ تای آنها حاوی ۱۰ میلی لیتر محیط کشت بند (۳ ـ ۱ ـ ۱) با غلظت دو برابر و ۶ تای آن محتوی ۱۰ میلی لیتر از محیط کشت بند (۳ ـ ۱ ـ ۱) با غلظت معمولی میباشد را انتخاب نمائید .
۶ ـ ۲ ـ ۲ ـ ۲ ـ به هر یک از لولههای ۱ و ۲ و ۳ طبق نمودار شماره ۱ به طور جداگانه توسط پیپت سترون ۱۰ میلی لیتر از نمونه مورد آزمون در صورت مایع بودن و یا ۱۰ میلی لیتر از سوسپانسیون اولیه را در مورد فرآوردههای غیر مایع اضافه کنید .
۶ ـ ۲ ـ ۲ ـ ۳ ـ به هر یک از لولههای ۴ و ۵ و ۶ نمودار شماره ۱ به طور جداگانه توسط پیپت سترون ۱ میلی لیتر از نمونه مورد آزمون مایع و یا ۱ میلی لیتر از سوسپانسیون اولیه را در مورد فرآوردههای غیر مایع اضافه نمائید .
۶ ـ ۲ ـ ۲ ـ ۴ به هر یک از لولههای ۷ و ۸ و ۹ نمودار شماره ۱ به طور جداگانه توسط پیپت سترون ۰/۱ میلی لیتر از نمونه مورد آزمون در صورت مایع بودن و یا ۰/۱ میلی لیتر از سوسپانسیون اولیه را در مورد فرآوردههای غیر مایع اضافه نمائید .
۶ ـ ۲ ـ ۲ ـ ۵ ـ نه لوله آزمایش را به مدت ۲۴±۲ ساعت در گرمخانه ۳۷ درجه سلسیوس قرار دهید پس از طی این مدت در صورت مشاهده نشدن گاز لولهها را برای ۲۴ ساعت دیگر در گرمخانه قرار دهید .
۶ ـ ۲ ـ ۲ ـ ۶ ـ پس از گذشت ۴۸ ساعت گرمخانه گذاری اگر در هیچیک از لولهها گاز تشکیل نگردد نمونه از نظر وجود کلی فرمها منفی میباشد .
۶ ـ ۲ ـ ۲ ـ ۷ ـ اگر در لولههای بند (۶ ـ ۲ ـ ۲ ـ ۵) پس از ۴۸ ساعت گرمخانه گذاری گاز تشکیل گردد ( حتی یک لوله ) هر کدام از لولههای گاز مثبت را به طور جداگانه از نظر کلی فرمها مورد بررسی قرار دهید .
۶ ـ ۲ ـ ۲ ـ ۸ ـ برای تائید کلیفرمها توسط حلقه کشت ( قطر حلقه سه میلی متر ) یک حلقه کامل یا با پیپت سترون یک قطره از هر یک از لولههای محتوی گاز برداشت کرده و به طور جداگانه در محیطهای بند (۳ ـ ۱ ـ ۲) کشت دهید و مدت ۲۴ الی ۴۸ ساعت در ۳۷ درجه سلسیوس گرمخانه گذاری نمائید .
۶ – ۲ – ۲ – ۹ – پس از گذشت ۴۸ ساعت اگر در هیچیک از لولهها گاز تشکیل نگردد نمونه از نظر وجود کلیفرمها تائید نمیگردد و منفی خواهد بود .
۶ ـ ۲ ـ ۲ ـ ۱۰ ـ اگر در هر یک از لولههای بند (۶ ـ ۲ ـ ۲ ـ ۸) پس از ۲۴ یا ۴۸ ساعت گاز تشکیل گردد نمونه از نظر وجود کلی فرمها تائید میگردد . در این صورت با در نظر گرفتن تعداد لولههایی که نتیجه آنها از نظر وجود کلی فرمها مثبت میباشند توسط جدول شماره ۱ شمارش نمائید .
فرض کنید ۱۰ میلی لیتر از نمونه با ۹۰ میلی لیتر از محلول رقیق کننده رقیق شده که رقت به دست میآید . اگر از لولههای گروه اول یک لوله مثبت و از لولههای گروه دوم دو لوله مثبت و لولههای گروه سوم نیز سه لوله مثبت باشد با مراجعه به جدول عدد ۲۴ به دست میآید که نشان دهنده وجود حداقل ۲۴ باکتری در ۱۰۰ میلی لیتر رقت تهیه شده میباشد بنابراین ۲۴۰=۱۰*۲۴ یعنی در هر ۱۰۰ میلی لیتر از نمونه اولیه ۲۴۰ باکتری کلی فرم وجود دارد .
۶ ـ ۲ ـ ۳ ـ شمارش به روش ۵ لولهای
روش فوق مشابه با روش ۳ لولهای است با این تفاوت که به جای ۳*۳ از ۵*۳ لوله استفاده میشود و در ۵ لوله اول ۱۰ میلی لیتر , در ۵ لوله دوم ۱ میلی لیتر و در ۵ لوله سوم ۰/۱ میلی لیتر از نمونه مورد آزمون در صورت مایع بودن و یا از سوسپانسیون اولیه در مورد فرآوردههای غیر مایع اضافه نمائید . روش آزمون تائید و بررسی نتایج را مشابه با روش ۳ لولهای انجام دهید و طبق جدول شماره ۲ شمارش نمائید .
یادآوری :
در صورتی که محیط کشت بند (۳ ـ ۱ ـ ۱) در دسترس نمیباشد از محیط کشت بند (۳ ـ ۱ ـ ۳) استفاده نمائید .
تماس با کارشناسان 